［本站讯］近日，微生物技术国家重点实验室张友明团队在Red/ET联用CRISPR/Cas9介导的细菌基因组多位点编辑技术开发和应用方面取得重要进展，相关研究成果以“ReaL-MGE is a tool for enhanced multiplex genome engineering and application to malonyl-CoA anabolism”为题发表在Nature Communications杂志上。山东大学博士后郑文韬、硕士王宇璇、博士生崔洁为论文的共同第一作者，王雪研究员、卞小莹教授、张友明教授和Francis Stewart教授为共同通讯作者，微生物技术国家重点实验室为第一完成单位和通讯作者单位。

本课题组前期工作首次发现了细菌胞内dNTP水平对于Red/ET重组工程的重要影响，建立了基于dsDNA重组工程的细菌多元基因组编辑方法（dReaMGE）（Nucleic Acids Res，2022 Feb 22;50(3):e15）。dReaMGE技术极大地简化了细菌基因组多元编辑的流程，解决了dsDNA重组工程在多重基因组编辑技术中的缺失，对原核基因组工程具有广泛的意义。但是dReaMGE技术存在重组效率不够高，同时编辑的位点个数被限制；抗性基因标记依赖，标记回收耗时、引入重复序列等问题。在本研究中，针对dReaMGE技术中存在的筛选标记依赖的问题，新技术中引入了CRISPR/Cas9系统用于刺激重组和进行反向筛选；针对CRISPR/Cas9系统介导基因组多位点编辑中面临的多gRNA表达载体构建困难耗时费力的问题，在多种细菌中实现了多gRNA的CRISPR-Cas系统线性化表达；针对多区域编辑效率受限于同源重组效率的问题，选择通过对核酸外切酶Exo VII的不同亚基（XseA和XseB）进行有针对性的调控，进一步提高同源重组效率。综合以上策略，研究人员联合dReaMGE技术和CRISPR/Cas9技术建立了细菌多重基因组编辑技术ReaL-MGE（Recombineering and Linear CRISPR assisted Multiplex Genome Editing），该技术可以在一周内通过一轮编辑完成非模式细菌基因组21个位点千碱基级别序列的同时插入编辑，而不引发任何脱靶问题。

ReaL-MGE技术原理以及在丙二酰辅酶A衍生品细胞工厂构建中的应用

本研究以关键技术ReaL-MGE为依托结合基因组和转录组数据分析分别对具有出色生物合成潜力的大肠杆菌E. coli BL21、伯克氏菌S. brevitalea DSM7029和假单胞菌 P. putidaKT2440的进行丙二酰辅酶A代谢网络改造、基因组优化以及木质纤维素降解和利用网络激活，构建了生长和生产性能得到共提升的丙二酰辅酶A衍生品微生物细胞工厂，实现抗肿瘤化合物埃博霉素（epothilones）和抗氧化、抗炎化合物芦荟松（Aloesone）的高效生物合成，打通了天然木质纤维素向抗肿瘤化合物高效生物转化的通路，并获得了细菌丙二酰辅酶A生产能力提升的普适性策略，为更多丙二酰辅酶A衍生品微生物细胞工厂的构建提供新思路。ReaL-MGE是解除了底物类型和长度限制、编辑位点数量和位置限制的基因组超多位点精准编辑技术，高效、精准和不脱靶的优点证明其是基因组系统性编辑工具库的优秀扩充。

上述研究成果得到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金、山东省自然科学基金、江苏省自然科学基金等项目的资助。山东大学生命环境研究公共技术平台为该工作提供了重要技术支持。