［本站讯］1月2日，山东大学基础医学院/高等医学研究院/卫健委耳鼻喉重点实验室孙金鹏教授团队联合山东大学基础医学院易凡教授团队、四川大学华西医院邓成教授团队，在Cell杂志在线发表了题为“Evolutionary study and structural basis of proton sensing by Mus GPR4 and Xenopus GPR4”的研究论文。山东大学高等医学研究院博士后文鑫，山东大学基础医学院博士后尚攀，四川大学华西医院博士后陈海迪，山东大学高等医学研究院研究员郭璐璐，山东大学基础医学院博士研究生荣乃康、蒋晓钰，硕士研究生李瑄和中南大学湘雅医院博士研究生刘俊彦为本文的共同第一作者；孙金鹏，邓成，山东大学基础医学院教授杨帆、张鹏举，易凡为本论文共同通讯作者。山东大学为第一作者单位和通讯作者单位。
图1 文章模式图
生物体可以通过感知、分析和响应内外环境的刺激，维持内稳态并适应复杂多变的外部环境。人类通过调节呼吸速率和肾脏功能，维持稳定的血液pH值，通常在7.32到7.42之间。为了满足日常能量需求，线粒体中的质子与碳酸氢盐缓冲系统相互作用，生成大量的二氧化碳（CO2）。这些CO2随后通过血液运输，最终通过呼吸排出或以肾酸形式由肾脏排泄。这些过程由质子感应受体（如GPR4）精密调控，确保了生理pH水平的稳定，进而保障了细胞功能的正常运作和整体健康。
在进化过程中，动物不断发展出适应其栖息地（如海洋、河流、热带雨林、高原和沙漠等）的生理机制，以应对不同环境中质子浓度的变化。为了维持正常生命活动，动物通过离子通道或GPR4等GPCR监测细胞外质子浓度的变化，并将这些信息传递给细胞，从而促使其作出相应的生理反应。GPR4起源于软骨鱼（银鲛），在调节呼吸频率、肾脏功能以及恢复pH平衡方面发挥了重要作用。同时，GPR4也在心血管系统中表达，并起到保护作用。尤其值得一提的是，不同于传统的GPCR配体，质子特别小，所以可能会有很多个受体的结合位点。所以，至今关于GPR4如何感知质子的分子机制，以及动物如何进化以适应不同环境中的质子浓度变化，仍不完全清楚。
基于此，该研究从进化、功能和结构角度，阐释了不同物种GPR4在质子感知中的共同机制以及物种特异性的独特机制，进一步描述了特定的质子感知GPCR是如何进化以适应不同生物的不同生活方式。
图2 不同物种中GPR4的活性最适pH
追溯GPR4的进化，可以发现它存在于哺乳动物、爬行动物、两栖类动物和鱼类中，但在鸟类中缺失。研究团队对不同的物种血液pH进行了测量，以及分析了不同脊椎动物物种中GPR4质子感知范围及其下游Gs-cAMP活性。结果发现两栖动物中的牛蛙以及爪蟾等具有偏酸的最适pH范围。重要的是，研究发现GPR4的活性最佳pH值与不同物种的血液pH值范围呈正相关(图2)。非洲爪蟾GPR4（xtGPR4）经受了正选择压力，表现出最酸性的最优pH范围，这可能与其长期潜水能力及几乎完全水生的生活方式相关。
多数现存的两栖动物，如蟾蜍和蛙类，仍然是半水生的，而非洲爪蟾（Xenopus）则几乎完全水生。这些半水生两栖动物可以自愿潜水长达1.5小时甚至更久，但在潜水后并未表现出过度通气现象，而爪蟾则可以潜水长达14小时且不会发生呼吸性酸中毒。于是推测，美洲牛蛙（R. catesbeiana）GPR4（rcGPR4）和热带非洲爪蟾（X. tropicalis）GPR4（xtGPR4）之间的最优pH差异可能与它们的潜水能力相关，从而支持其不同的生活方式。
图3 活性最适pH下小鼠和爪蟾GPR4关键H的周围相互作用
随后，研究者们解析了热带非洲爪蟾（xtGPR4）和小鼠（mmGPR4）在不同pH条件下的受体单体或与Gs三聚体复合物的冷冻电镜结构。通过观察xtGPR4和mmGPR4在不同pH条件下的7个冷冻电镜结构并结合功能分析，研究发现，在不同的进化相关物种中存在共同的质子感知和质子诱导的GPR4激活机制。两个在进化上保守的组氨酸，被确定为pH诱导GPR4激活的两个关键质子传感器（图3）。这两个His质子化到HIP态（咪唑环上的两个氮都被质子化，咪唑基带正电荷），使得这些残基充当氢键供体并构成新的极性网络（图3），这导致ECL2的重排以及ECL2和7TM区域变得更加紧密地结合。随后，这些结构改变通过保守传播路径传播到“拨动开关”Y/F6.48位置。经过序列比较和物种分析，这2个关键的H及其形成的极性网络，是不同物种GPR4质子感知和激活的共同机制。尽管具有共同的质子感应机制，但不同物种的GPR4通过独特的质子感应机制进化。例如，H159ECL2-45.51仅存在于xtGPR4中，而不存在于哺乳动物或其他物种中，这表明了一种独特的进化途径。此外，受到选择压力的位点突变结果表明， S171.32和E156ECL2-45.48可能在xtGPR4活性相对酸性的最佳pH范围中发挥着重要作用。
综上所述，此项研究揭示了GPR4在进化过程中如何适应周围环境和pH，感知质子和调节酸碱平衡，发现了多种物种血液pH与GPR4活性最佳pH成正相关。同时阐释了不同物种中质子化诱导GPR4激活的共同机制和独特的适应机制，对质子感知受体如何激活和传递提供了相关见解。
本研究得到国家重点研发计划基金、国家自然科学基金重点项目、山东省自然科学基金等基金支持。
孙金鹏团队长期致力于GPCR的配体发现、药物靶点确证、功能研究和小分子确证，以通讯作者在Nature（8篇），Science（1篇），Cell (3篇）等发表多篇文章，揭示了痒觉受体的内源性配体和独特的激活模式（Nature. 2021;600(7887):164-169）；阐释了黏附类受体对力的感知机制并发展了多肽激动剂和拮抗剂（（Nature. 2022a 604(7907):771-778;Nature. 2022b 604(7907):763-770）;解析了嗅觉受体对气味的感知机制(Nature. 2023 Jun;618(7963):193-200)。
易凡团队长期从事GPCR在肾脏中的功能和调控机制，与孙金鹏教授长期合作，揭示了肾脏中黏附类GPCR GPR97在急性肾损伤中促炎并加重肾损伤的机制及其内源性配体糖皮质激素（Nature, 2021a; 589: 620-626，J Am Soc Nephrol. 2018; 29:1475-1489），以及氧化型胆固醇受体GPR183促进内皮衰老及心肾损伤的新机制及干预策略（Circ Res. 2024 Sep 13;135(7):708-721）。
